LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Biologisk aktivitet

In Vitro   

Wild-type og G2019S transduksjon resulterer i 2,5 ganger høyere TR-FRET-signal som kan hemmes avLRRK2-I-1på en doseavhengig måte med IC50-verdier på henholdsvis 0,08 μM og 0,03 μM. LRRK2-IN-1 hadde en IC50 på 45 nM for hemming av DCLK2 og viser en IC50 på mer enn 1 μM når evaluert i biokjemiske analyser for AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 og PLK1. LRRK2-IN-1 er bekreftet å hemme MAPK7 med en EC50 på 160 nM. LRRK2-IN-1 induserer en doseavhengig hemming av Ser910 og Ser935 fosforylering ledsaget av tap av 14-3-3 binding til både vill type LRRK2 og LRRK2[G2019S] stabilt transfisert i HEK293 celler[2]. LRRK2-IN-1 er moderat cytotoksisk med IC50 på 49,3 μM i HepG2-celler. LRRK2-IN-1 viser gentoksisitet i nærvær og fravær av S9 ved henholdsvis 15,6 og 3,9 μM. LRRK2-IN-1 hemmer spredning, migrasjon og induserer celledød med kjennetegn på apoptose av HCT116- og AsPC-1-celler[4]..

I Vivo    

LRRK2-IN-1 (100 mg/kg, i.p.) induserer defosforylering av LRRK2 i nyrene til musene[2]. Peritumoral injeksjon av LRRK2-IN-1 (100 mg/kg) resulterer i en signifikant reduksjon i tumorvolum og vekt av AsPC-1 tumor xenografts[4].

Kinase analyse 

Aktiv GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) og GST-LRRK2 [A2016T+G2019S] (1326-2527) enzymet renses med glutation sepharose fra HEK293 cellelysat 36 h etter forbigående transfeksjon av de aktuelle cDNA konstruksjoner. Peptid kinase analyser, utført i duplikat, er satt opp i et totalt volum på 40 μL som inneholder 0,5 μg LRRK2 kinase (som på ca 10% renhet gir en endelig konsentrasjon på 8 nM) i 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 μM Nictide, 0,1 μM [γ-32P]ATP (500 cpm/pmol) og de indikerte konsentrasjonene av inhibitor oppløst i DMSO. Etter inkubasjon i 15 min ved 30 °C avsluttes reaksjonene ved å oppdage 35 μL av reaksjonsblandingen på P81 fosfolicellulosepapir og nedsenking i 50 mM fosforsyre. Prøver vaskes mye og inkorporering av [γ-32P] ATP i Nictide er kvantifisert av Cerenkov telling. IC50-verdier beregnes med GraphPad Prism ved hjelp av ikke-lineær regresjonsanalyse.

Celleanalyse

Celler (104 celler per brønn) seedes inn i en 96-brønns vevkulturplate i triplicate. Cellene er kultivert i nærvær av LRRK2-IN-1 med DMSO som et kjøretøy på 0, 0,31, 0,63, 1, 2 og 5, 10 og 20 μM. 48 timer etter behandling, 10 μL TACS MTT Reagens tilsettes hver brønn og cellene inkuberes ved 37 °C til mørk krystallinsk bunnfall blir synlig i cellene. 100 μL på 266 mM NH4OH i DMSO legges deretter til brønnene og plasseres på en plateshaker ved lav hastighet i 1 minutt. Etter risting får platen inkubere i 10 minutter beskyttet mot lys, og OD550 for hver brønn leses ved hjelp av en mikroplateleser. Resultatene er gjennomsnitt og beregnet som en prosentandel av DMSO (kjøretøy) kontroll +/- standardfeilen i gjennomsnittet.

Dyr Admin

LRRK2-I-1oppløses i Captisol og administreres ved intraperitoneal injeksjon til vill type hann C57BL/6 mus i en dose på 100 mg/kg. Kontrollmus injiseres med like mye Captisol. Ved 1 og 2 timer blir mus extinguwashed av cervical dislokasjon og nyre og hjernevev raskt dissekert og snap-frosset i flytende nitrogen.

Referanser

[1]. Hermanson SB, et al. Screening for Novel LRRK2 Inhibitors Using a High-Throughput TR-FRET Cellular Assay for LRRK2 Ser935 Phosphorylation.PLoS One. 2012;7(8):e43580. Epub 2012 28.

[2]. Deng, Xianming., et al. Karakterisering av en selektiv hemmer av Parkinsons sykdom kinase LRRK2. Naturkjemisk biologi (2011), 7(4), 203-205.

Koshibu K, et al. Alternativ til LRRK2-IN-1 for farmakologiske studier av Parkinsons sykdom. Farmakologi. 2015;96(5-6):240-7.

[4]. Weygant N, et al. Liten molekyl kinase hemmer LRRK2-IN-1 viser potent aktivitet mot kolorektal og bukspyttkjertelkreft gjennom hemming av dobbelcortin-lignende kinase 1. Mol Kreft. 2014 Mai 6;13:103